寡核苷酸療法是一種新興的治療方式，通過專門設(shè)計合成修飾的RNA或RNA/DNA 雜交體，以改變RNA和/或蛋白質(zhì)表達調(diào)控疾病基因轉(zhuǎn)錄，被美國食品藥品管理局（FDA）或歐盟批準用于治療罕見病。近年來，寡核苷酸藥物取得了長足的進步，截至2022年1月，全球已獲批上市的小核酸藥物共有14款，包括4款小干擾RNA（siRNA）藥物，9款反義寡核苷酸（ASO）和1款核酸適配體(Aptamer)（行研報告 小核酸藥物行業(yè)，36，2022.1.11）。截至目前，有超50款處于臨床實驗階段。
FDA于2022年6月出臺了《Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry》，提供了幫助行業(yè)開發(fā)寡核苷酸療法的建議，涉及藥代動力學、藥理學和安全性評估?！吨改稀肪秃螘r進行這些評估以及何種類型的評估適合解決哪些問題提供了建議。
為了滿足寡核苷酸藥物的研發(fā)需求，匯智泰康憑借多年來在生物醫(yī)藥研發(fā)、生物安全評價和分析檢測領(lǐng)域積累的技術(shù)、方法和項目經(jīng)驗，開發(fā)了針對寡核苷酸藥物的血漿蛋白結(jié)合試驗方法，構(gòu)建了寡核苷酸藥物的臨床前藥物研發(fā)服務(wù)體系，可以承接寡核苷酸藥物臨床前實驗相關(guān)研究工作，具體描述如下：
1.血漿蛋白結(jié)合率（plasma protein binding，PPB）試驗
PPB通過檢測藥物入血后與血漿蛋白結(jié)合形成結(jié)合態(tài)藥物的比例，判斷藥物在血漿中的存在形式，為藥物作用機理研究、藥物活性研究、用藥方法研究等提供參考數(shù)據(jù)。實驗過程包括：RNA與蛋白結(jié)合孵育過程，游離藥物分離過程（可根據(jù)藥物特點選用平衡透析法（ED）、超濾法（UF）、固相萃取法（SPE）等），和游離藥物檢測（可選用高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS、LC-MS/MS）、熒光標記RNA的液相色譜-熒光檢測（LC-FLD）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）檢測法等。血漿可以根據(jù)需要選擇人、猴、犬、大鼠、小鼠等不同種屬。
圖1 RNA蛋白結(jié)合率試驗過程示意圖
圖2 某RNA-熒光標記物的色譜圖
2.體外藥物代謝實驗
體外代謝研究可通過直接考察候選化合物與受試靶點的選擇性作用，主要涉及代謝產(chǎn)物鑒定、代謝穩(wěn)定性、以及藥物代謝性相互作用等。代謝產(chǎn)物鑒定，可通過LC-MS/MS和高分辨質(zhì)譜（Triple QTOF-MS）進行分子量鑒定，進而推斷代謝路徑。
代謝穩(wěn)定性實驗，如血漿代謝穩(wěn)定性、肝微粒體代謝穩(wěn)定性、肝細胞代謝穩(wěn)定性等，均可涉及人、猴、犬、大鼠、小鼠等多個種屬。對于血漿代謝穩(wěn)定性，可以通過LC-MS/MS測定從血漿中提?。刹捎肨rizol提取法、蛋白K酶消解法、固相萃取法、磁珠雜交提取法等）得到的RNA。對于肝微粒體代謝和肝細胞代謝，可以先應(yīng)用LC-MS/MS和Triple QTOF-MS對其代謝產(chǎn)物進行鑒定，進而應(yīng)用LC-MS/MS進行定量分析。
藥物代謝性相互作用研究，可根據(jù)國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《藥物相互作用研究技術(shù)指導原則（征求意見稿）》開展相關(guān)實驗和研究。
3.動物藥理藥效安全評價實驗
可開展大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔、猴、小型豬、犬等臨床前研究動物實驗。
匯智泰康寡核苷酸藥物研發(fā)相關(guān)配套儀器設(shè)備：
- 核酸電泳儀（BAYGENE-BG-POWER 600 等）
- PCR擴增儀（美國伯樂T100 等）
- 酶標儀（美國博騰ELx808等）
- 蛋白純化儀（利穗科技APPS 50D等）
- 一體化凝膠成像儀（北京賽智SmartGel 140 等）
- 高速冷凍離心機（GL-21M 等）
- 高效液相色譜儀（紫外、熒光）（ Agilent1200 Series等）
- 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500、API 5000、QTRAP 4500、Triple QTOF 5600+等）
